Глава 10. ЖЕСТЫ ВКЛЮЧЕНИЯ В жизни мы часто выполняем жесты включения, не задумываясь об их глубинном смысле. Это особые позы тела, а также соединения рук и пальцев, которые позволяют включать скрытые возможности, концентрировать их на каком-то действии. А самое главное -

Практика включения перспектив

Практика включения перспектив Модуль ума в ПИЖ обладает двумя основными измерениями:1. Практика, укрепляющая ваши способности к более тонкому, целостному и точному восприятию различных перспектив.2. Практика расширения умственных моделей, применяемых для организации

«Якорь» включения в работу

«Якорь» включения в работу Любите ли вы музыку? Как известно, музыка всегда влияет на психофизиологические механизмы нашего организма.Подумайте, какая музыка (песня) поднимает вам настроение и общий уровень энергетики?Какая мелодия успокаивает вас и расслабляет душу и

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения.

Тельца включения представляют собой частицы, состоящие из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует ренатурации, в процессе обработки белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок.

Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в результате трансляции мРНК рибосомами в эндоплазматическом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. Внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5-5,5. pH цитоплазмы бактериальных клеток около 7,8, в этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Ca2+.

Посттрансляционные модификации белков (фосфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и ограниченный протеолиз), происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток, также влияют на растворимость белков, их стабильность и биологические функции. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии.

На растворимость белков влияет их нативная конформация в растворе. Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками шаперонами , а так же фолдазами и изомеразами .

Поскольку условия, необходимые для поддержания эукариотических рекомбинантных белков в растворимой форме, не могут быть реализованы в бактериальных клетках, в них происходит агрегация рекомбинантных белков с образованием телец включения. Не существует универсального метода, позволяющего получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных клетках в нативном виде. В некоторых случаях уже понижение температуры выращивания рекомбинантных бактерий до 30o приводит к образованию полностью растворимых рекомбинантных белков. Это наблюдали в случае рекомбинантного гамма-интерферона , A-цепи рицина , щелочного фактора роста фибробластов и в ряде других случаев.

Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секретируемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того, у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Примером эффективного использования секреторной системы E. coli является получение рекомбинантного инсулино-подобного фактора роста I (IGF-I) в секретируемой форме. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры.

Возможным подходом к эффективному синтезу растворимых рекомбинантных белков в бактериальных клетках является введение экспрессирующихся генов шаперонов в клетки бактерий-хозяев. Так, сверхэкспрессия гомологичного gro-оперона в клетках E. coli, содержащих экспрессирующиеся гены большой и малой субъединиц Rubisco цианобактерии Anacistis nidulans, приводила к 5-10- кратному возрастанию внутриклеточного содержания нативного рекомбинантного белка Rubisco. В некоторых случаях внутриклеточную агрегацию сверхэкспрессирующихся белков удается предотвратить искусственной заменой отдельных аминокислот в полипептидных цепях методами белковой инженерии . Например, удаление семи аминокислот перед спиралью G в N-концевой части полипептидной цепи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli , а также замена нескольких гидрофобных аминокислот, боковые цепи которых экспонированы на поверхности спирали G, на остатки аспарагина полностью предотвращали внутриклеточную агрегацию фрагмента и образование агрегатов в процессе его очистки. В нативной молекуле ДНК-полимеразы I участок полипептидной цепи, в котором проведены замены, закрыт доменом 5"->3"-экзонуклеазы, отсутствующим у фрагмента Кленова, и не оказывает влияния на агрегационные свойства фермента.

Для обнаружения вируса чаще всего используют экспресс-методы, которые позволяют в материале:

1) обнаружить вирусные белки (антигены). Для этой цели используют серологические реакции: РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДО;

2) обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ДНК-зонда;

3) обнаружить вирионы вирусов. Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирусы любых размеров, а крупные вирусы (вирусы оспы) можно увидеть под световым микроскопом. Этот метод называется вирусоскопия.

Электронная микроскопия используется в основном в исследовательских целях. Электронный микроскоп - сложный и дорогой прибор, в диагностических ветеринарных лабораториях его нет. Хотя исследование с его помощью - очень эффективный экспресс-метод при диагностике рота-, коронавирусных и других инфекций. Если в материале содержится не менее 10 7 вирионов на 1 мл, он не требует дополнительных методов очистки и концентрации;

4) обнаружить тельца-включения под световым или люминесцентным микроскопом.

Тельца-включения - это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под действием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме (чаще это РНК-содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных - Ленца, при бешенстве - Бабеша-Негри и др. При обнаружении телец Бабеша-Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение;

5) обнаружить вирусные гемагглютинины, которые являются белками некоторых вирусов (орто-, парамиксовирусов и др.).

Гемагглютинирующие вирусы способны агглютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температуры и pH среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале;

6) для обнаружения вируса в активной форме (инфекционной) используют довольно длительные вирусологические исследования. С этой целью применяют метод биопробы на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток. В редких случаях приходится использовать естественно восприимчивых животных.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

1. Вирусы, их строение и отличие от других живых систем

2. Основы современной классификации вирусов

3. Внутриклеточные включения

4. Устойчивость вирусов, их очистка и концентрирование

5. культивирование вирусов, их патогенность и вирусологические исследования

6. Развитие вирусологии на современном этапе

Вирусы, их строение и отличие от других живых систем

Вирусы – это внеклеточная форма жизни, обладающая собственным геномом и способностью воспроизводиться только в живых клетках. По содержанию нуклеиновых кислот вирусы отличаются от живых систем, тем, что у них одна кислота (РНК или ДНК), а у других организмов их две. Число белковых молекул в вирусных белках самое разнообразное, но оно всегда больше, чем у белков высших организмов. Вирусы воспроизводят себе подобных в огромном количестве и своеобразным способом – репродукцией – так как здесь копируются молекулы нуклеиновой кислоты и по их генетической информации синтезируются вирусные белки. Репликацию нуклеиновых кислот осуществляют ферменты – они из клеточных нуклеотидов строят полинуклеотидные цепи новых молекул нуклеиновых кислот вирусов. Являясь неклеточной формой жизни, вирусы тем не менее имеют корпускулярную структуру и определенную для каждого вида морфологию. Величина вирусов варьирует в широких пределах: возбудитель ящура имеет величину до 30 нм, вирус коровьей оспы - около 200 нм. Определение величины вируса достигается фильтрацией через фильтры с известной величиной пор, центрифугированием в скоростных центрифугах, что позволяет по скорости оседания судить о величине частиц, и наконец, исследованием в электронном микроскопе. Инфекционные единицы вирусов называют вирионами. Каждый вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной оболочками. Белковую оболочку называют капсидом. Структура, состоящая из нуклеиновой кислоты и окружающего ее капсида, именуется нуклеокапсидом. Различают два типа симметрии строения капсида: кубический и спиральный. У некоторых вирусов капсиды окружены второй липо - или гликопротеидной оболочкой. У отдельных вирусов выявлено наличие собственных ферментов. Нуклеиновая кислота несет в себе наследственные признаки, она непосредственно участвует в синтезе белка и, кроме того, является фактором инфекционности вируса, а белок обеспечивает антигенную специфичность и стимулирует образование антител.

Основы современной классификации вирусов

Современная классификация – универсальная. Она основана на фундаментальных свойствах вирусов, из которых ведущими являются признаки, характеризующие нуклеиновую кислоту, морфологию вирусов, стратегию вирусного генома и антигенные свойства. Стратегия вирусного генома – это используемый вирусом способ репродукции, обусловленный вирусным геномом.

Так как по своим свойствам вирусы отличаются от других микроорганизмов, то по современной классификации они выделены в самостоятельную группу – царство или тип VIRA. Классификация вирусов предусматривает следующие таксономические группы: вид, род, семейство, класс, отряд, тип.

Номенклатура вирусов также является международной и универсальной. Всем вирусам присвоены латинские названия. Названия семейств принимают окончание viridae, родов – virus. Научные названия вирусов пишутся с заглавной буквы и состоят из двух латинских слов, означающих род (стоит на первом месте и пишется с прописной буквы) и вид (стоит на втором месте и пишется со строчной буквы).

Все вирусы, в зависимости от того, кого они поражают, подразделяются на следующие группы:

Ø вирусы позвоночных (человека, животных, птиц)

Ø вирусы растений

Ø вирусы простейших (микроорганизмов)

Ø вирусы беспозвоночных (насекомых)

Современная классификация охватывает более 80% известных вирусов. В основу современной классификации положено:

Ø Тип нуклеиновой кислоты и ее структура.

Ø Наличие второй липопротеидной оболочки.

Ø Размер и морфология вириона.

Ø Стратегия вирусного генома.

Ø Тип симметрии капсомеров.

Ø Число капсомеров в капсиде.

Ø Генетические взаимодействия.

Ø Круг восприимчивых хозяев.

Ø Патогенность.

Ø Географическое распространение.

Ø Способ передачи.

Ø Антигенные свойства.

Ø Чувствительность вирионов к органическим растворителям.

Ø Место репродукции вирионов.

Ø Способность агглютинировать эритроциты

Внутриклеточные включения

При ряде вирусных болезней (оспа, бешенство) обнаруживают внутриклеточные тельца-включения (элементарные тельца). При применении особых методов окраски (по Морозову, по Романовскому - Гимзе и др.) их удается увидеть в световом микроскопе. Включения могут располагаться в цитоплазме клеток и ядре. По составу они разнообразны, но в большинстве своем состоят из вирусных частиц.

Обнаружение телец-включений при ряде инфекционных болезней (например, при бешенстве) имеет диагностическое значение.

Внутриклеточные включения – это вирусный материал и реакция клетки на вирусный материал.

1. По локализации в клетке включения делятся:

1 – цитоплазматические

2 – внутриядерные

3 – смешанные

2. По составу нуклеиновой кислоты:

3. По тинкториальным свойствам:

1 – базофильные

2 – оксифильные

4. По гомогенности:

1 – аморфные

2 – зернистые

Цитоплазматические включения обнаруживаются в клетке при размножении в них крупных вирусов (оспа, бешенство). Они представлены в виде округлых, овальных или неправильной формы образований с диаметром от 1-2 до 20-30 мкм. В пораженной клетке может быть несколько включений. Чаще включения прилегают к ядру, несколько смещая его, или вообще окружают ядро и для каждого цитоплазматического включения характерна гомогенная структура.

Ядерные включения встречаются при заражении крупными и мелкими вирусами, причем ядерные включения отличаются от ядрышка своими тинкториальными свойствами.

Влияние возраста животного: у молодых включения встречаются чаще, у взрослых – реже.

Устойчивость вирусов, их очистка и концентрирование

Очистка и концентрирование вирусов достигается путем фильтрации через специальные фильтры с использованием синтетических смол и полимерных материалов, а также путем ультраскоростного центрифугирования. Эти методы позволяют также выделить отдельные компоненты (фракции) вирусов.

Устойчивость вирусов к воздействию факторов внешней среды и разного рода физическим факторам и химическим веществам различна и зависит от строения и химического состава вирусов, наличия защитных оболочек, от среды, в которой находится вирус. Степень устойчивости соответствует механизму передачи вируса. Наиболее устойчивы вирусы, которые передаются алиментарным путем (классическая чума свиней, ящур) или через наружные покровы (контагиозный пустулезный дерматит овец и коз). Менее устойчивы вирусы, передающиеся воздушно-капельным (респираторным) или трансмиссивным путем.

У вирусов есть две формы существования. При вегетативной форме вирус тесно связан с клеткой и его сохранность полностью зависит от клетки. Этот процесс неполно изучен.

Устойчивость вирионов изучена хорошо. В защите от факторов внешней среды основную роль выполняет белковая оболочка – капсид. И так как он у разных вирусов устроен по-разному, то и устойчивость разная (вирусы, имеющие в капсиде липиды быстро инактивируются жирорастворителями, а если их нет, то к жирорастворителям они не чувствительны).

Устойчивость вирусов имеет большое практическое значение. Способность вирусов погибать при действии одних факторов и сохраняться под действием других – широко используется при изготовлении инактивированных вакцин, консервировании вакцин.

При вирусных болезнях в организме животного идет интенсивное размножение вируса. В процессе болезни часть вирусов гибнет в организме, а часть выделяется во внешнюю среду и может сохраняться там и являться источником инфекции.

Культивирование вирусов, их патогенность и вирусологические исследования

Культивирование вирусов. Для размножения вирусов необходимо наличие живых, чувствительных к нему клеток. Поэтому культивирование вирусов осуществляют в организме восприимчивых животных, в клетках куриных эмбрионов и клетках культур тканей.

В клетку проникает нуклеиновая кислота вируса. В соответствии с заложенной в ней генетической информацией живая клетка начинает производить ферментные системы, а затем белковые компоненты и нуклеиновую кислоту вируса. После этого происходит «сборка» составных частей вируса из белковых молекул и нуклеиновой кислоты. Накопление вирусных частиц приводит, как правило, к разрушению клетки и выделению вирионов во внешнюю среду.

К использованию естественно восприимчивых животных для культивирования вирусов прибегают в настоящее время редко.

Чаще используют более прогрессивные методы. В клетках куриных эмбрионов культивируют вирусы коровьей оспы, оспы-дифтерита птиц, инфекционного ларинготрахеита, ньюкаслской болезни, чумы плотоядных.

Внедрение в практику вирусологических исследований метода культур клеток сыграло огромную роль в дальнейшем развитии вирусологии. Различают два типа клеточных культур: 1) клетки культур переживающих тканей (первично трипсинизированные) получают путем механического (измельчение) и ферментативного (трипсинизация) расщепления тканей из почек животных, плаценты, сердца, куриных эмбрионов (фибробласты куриного эмбриона); 2) клетки культур растущих тканей (перевиваемые) получают чаще всего из злокачественных опухолей. Используют также культуры диплоидных клеток, которые неопасны в канцерогенном отношении.

Выращивание культур клеток чаще производят в однослойных (монослойных) культурах. В этом случае клетки, внесенные в стеклянный сосуд, прикрепляются к одной из его стенок, образуя слой толщиной в одну клетку. Модификацией этого метода является выращивание культур клеток во вращающихся сосудах (роллерный метод), на пластинках, помещенных в сосуд, на микроносителе (гранулы полимерных материалов, на поверхности которых также образуется монослой клеток). Большинство вирусов по мере роста в однослойных культурах вызывают дегенерацию и гибель клеток, что называют цитопатогенным действием (ЦПД). Таким свойством обладают вирусы ящура, ньюкаслской болезни. Специфичность ЦПД устанавливают с помощью реакции нейтрализации со специфической сывороткой. Однако имеются вирусы, которые размножаются без проявления ЦПД (например, вирус классической чумы свиней). Существует также метод глубинного выращивания вирусов, при котором клетки находятся во взвешенном состоянии (в перемешиваемых суспензиях). Рост культур клеток и размножение вирусов происходят в питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, глюкозу, сыворотку и другие вещества.

Патогенное действие вирусов на организм животного связано с поражением чувствительных клеток. Это сопровождается местными и общими реакциями. На месте размножения вируса наблюдают распад клеток (например, слущивание эпителия), что зачастую сопровождается внедрением бактериальной флоры и накоплением различных токсических веществ, всасывание которых приводит к повышению температуры тела, нарушению обмена веществ. Специфичность действия вирусов связана с избирательным поражением определенных органов и тканей - тропизмом.

Вирус ящура, например, поражает в основном эпителиальные ткани, а бешенство - нервную ткань.

Общие реакции проявляются прежде всего повышением температуры тела, угнетением, отказом от корма. Отмечают также изменения форменных элементов и состава крови, образование антител, появление других клинических реакций (нарушение деятельности сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем), возникновение патологоанатомических изменений (воспалительные процессы лимфоидной ткани и др.).

Установлена возможность длительного вирусоносительства. Примером может служить вирус герпеса, патогенное действие которого проявляется лишь на фоне ослабления резистентности организма.

Некоторые вирусы (вирус классической чумы свиней) могут также длительно находиться в организме переболевшего животного.

Вирусологическое исследование - комплекс лабораторных исследований (биологических, морфологических, серологических), направленных на распознавание этиологии вирусной болезни, выделение и изучение ее возбудителя, а также на обнаружение в крови больных и переболевших животных специфических антител.

Возможность выделения вируса зависит от правильности взятия и хранения материала. В зависимости от характера болезни вирус выделяют путем заражения лабораторных или сельскохозяйственных животных, развивающихся куриных эмбрионов или культуры тканей. С целью дальнейшего изучения вирусы культивируют на чувствительных объектах. Изучают биологические свойства выделенного вируса: устойчивость к воздействию разных температур, красителей, лучистой энергии, рН среды, течение болезни у лабораторных животных. В РСК, реакциях нейтрализации, иммунофлуоресценции, гемагглютинации и задержки гемагглютинации, преципитации и др. определяют антигенные свойства выделенного вируса. Некоторые из этих реакций используют и для определения наличия антител в крови животных по заведомо известному вирусному антигену. По комплексу признаков, присущих выделенному вирусу, производят его идентификацию, то есть устанавливают принадлежность к определенному виду. Совокупность данных эпизоотологических, клинических, патологоморфологических, вирусологических и серологических исследований позволяет поставить диагноз при возникновении болезни вирусной этиологии.

Развитие вирусологии на современном этапе

Причины интенсивного развития вирусологии в последние годы:

1. Вирусные болезни занимают ведущее место, охватывают большое количество людей, животных и встречаются в 6-7 раз чаще, чем бактериальные болезни.

2. Против вирусных болезней не разработаны хорошие биологические препараты.

3. В последние годы получила признание вирусная теория происхождения опухолей (Зильбер). 150 видов вирусов могут вызвать опухоль.

Более 40 лет назад родилась генная инженерия (планирование) – можно конструировать новые живые системы.

5. В последние годы среди молодняка животных получили широкое распространение пневмоэнтериты. В появлении вспышек этих заболеваний тесно взаимодействуют инфекционныен вирусы и стрессовые факторы, причем вирусы действуют не в одиночку, а в сочетании с другими вирусами, микробами.

6. Установлено, что вирусы являются одной из причин внутриутробных патологий

7. Вирусы можно использовать в борьбе с насекомыми, с вредителями сельскохозяйственных культур.