VIVOS VOCO: А.С. Спирин, "Рибонуклеиновые кислоты как центральное звено живой материи"

Это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вирусных белков и репликация нуклеиновых к-т.

1. РНК пикорнавирусов выполняет роль и-РНК, транслируется на рибосомы, служит матрицей для образования единого гигантского полипептида. Последний расщепляется на несколько белков, один из кот-х является полимеразой. Начинается репликация той же РНК, освобождённой от рибосом.

2. РНК других вирусов служит матрицей, на кот-й транскрибируется и-РНК. Она транслируется на рибосомы, образуются определённые вирусные белки, один из кот-х - полимераза. Далее происходит репликация вирусной РНК, причём вначале образуется форма из 2-х нитей.

3. У онкогенных РНК-содержащих вирусов синтез идёт иначе. С матрицы РНК образуется ДНК-копия, имеющая 1 нить ДНК. В этом процессе участвует обратная транскриптаза, кот-я есть в вирионе. Затем идёт репликация этой нити ДНК, образуется 2 нити. На матрице этой ДНК-копии синтезируются молекулы РНК.

54. Какая разница между (+) и (-) вариантами 1-нитчатых РНК геномов?

Вирусные РНК делятся на + нити и - нити РНК.

+РНК представлены одиночными цепочками, имеющими характерные «шапочки» на концах для распознавания рибосом. К этой группе относят РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомах заражённой клетки, то есть выполнять ф-и м-РНК. Ф-и +нитей : служат м-РНК для синтеза структурных белков, матрицей для репликации РНК, упаковываются в капсид с образованием дочерней популяции.

-РНК не способны транслировать генетическую информацию на рибосомах. Служат матрицей для синтеза м-РНК.

Сущность радиоиммунного метода.

Используют очищенные и концентрированные Аг и АТ, меченные радиоизотопом (йодом).

Для выявления АТ – к исследуемой сыворотке добавляют меченый Аг. Титр АТ в сыворотке устанавливают по убыли свободного меченого Аг.

Для выявления Аг – исследуемый материал смешивают с антисывороткой, затем вносят гомологичный меченый Аг. Если меченый Аг остаётся свободным, реакция положительная , так как исследуемый Аг связался с сывороткой. Если меченый Аг уменьшается, это означает, что он взаимодействует с сывороткой – реакция отрицательная .

Используют для диагностики вирусного гепатита.

Как происходит заражение ВИЧ?

ВИЧ-инфекция – типичный антропоноз, у животных воспроизвести заболевание не удаётся. Резервуар вируса – инфицированный человек. Пути передачи:

1. Половой – через повреждения слизистых.

2. Использование одних игл и шприцев наркоманами.

3. Гемотрансфузионный – переливание крови и её препаратов.

4. Передача с донорскими органами.

ВИЧ чувствителен к д-ю высоких t°, этанола, эфира. В биологическом материале при комнатной t° жизнеспособен несколько дней.

Какие клетки поражает ВИЧ и какой рецептор имеют эти клетки? Мех-м развития ВИЧ.

Мишени для ВИЧ – Т-хелперы, моноциты, макрофаги, клетки микроглии.

Патогенез поражений: селективное поражение CD4 + -клеток, так как вирус использует CD4 как рецептор. В патогенезе 4 стадии:

I. Апоптоз – «запрограммированная» смерть клеток – при взаимодействии вирусов с рецепторной системой макрофагов нарушается «распознавание» вируса как чужеродного Аг.

II. Образование синцитиев – вирусы выходят в кровь и внедряются в новые незаражённые лимфоциты. Здоровые лимфоциты прилипают к поражённым. Активность лимфоцитов снижается под д-ем токсинов, образующихся при гибели клеток.

III. Аутоиммунные реакции – появление вирусных гликопротеинов на мембранах Т-хелперов приводит к активации Т-киллеров. Иммунная система не может противостоять даже сапрофитной флоре. Возникают «оппортунистические» инфекции.

IV. Инфицирование клеток-предшественников – при нормальном иммунитете эти клетки разрушаются, а в условиях иммунодефицита – активно размножаются. Возникают болезни злокачественного роста – саркома Капоши.

«Оппортунистические» инфекции – заболевания, вызванные микроорганизмом, способным поражать только индивидуумы с ослабленным иммунитетом.

Как устроен ВИЧ?

ВИЧ входит в состав ретровирусов. Характерно : уникальное строение генома и наличие обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза обеспечивает обратную направленность потока генетической информации – от РНК к ДНК (отсюда название).

Геном : 2 идентичные молекулы 1-нитевой несегментированной +РНК.

При репродукции образуются промежуточные продукты ДНК – особенности размножения ретровирусов . Выделяют ВИЧ-I и ВИЧ-II.

Зрелые вирионы : сферическая форма, d = 120 нм, в геноме 2 нити +РНК, капсид, суперкапсид из двойного липидного слоя, кот-й пронизывают гликопротеиновые шипы. Эти шипы взаимодействуют с молекулами CD4 на мембранах клетки.

Вирусы содержат лишь один вид нуклеиновых кислот – ДНК или РНК. Вирусная ДНК может быть одно- или двухцепочечной и иметь линейную или кольцевую форму. Вирусные нуклеиновые кислоты кодируют специфические для вирусов белки и ферменты, необходимые для репликации вируса в клетке хозяина.

Репликация ДНК-содержащих вирусов идет по общему для всех ДНК полуконсервативному механизму. На матрице вирусной ДНК сначала синтезируется мРНК, а дальше идет образование вирусных белков. Этот процесс полностью обеспечивается метаболическим аппаратом клетки-хозяина.

Репликация РНК-содержащих вирусов происходит двумя путями.

Первый идет при участии РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-синтазы или РНК- репликазы). Он присущ вирусам гриппа, кори. Различают вирусы:

• содержащие (+) - РНК цепь (плюс-цепь), которая служит как мРНК, так и геномом, и вирусы,
• содержащие (-) РНК цепь (минус-цепь), которая служит лишь геномом.

Существуют также вирусы, которые содержат двухцепочечную РНК.

1. (+)-РНК цепь вируса может непосредственно использоваться в трансляции в качестве мРНК. Поэтому, когда в клетку попадает (+) -РНК вирус (вирус полимиолиту, гепатита А), его РНК связывается с рибосомами клетки и транслируется в белковую цепь. Эта цепь разрывается протеазой вирусной частицы на 7 белков, один из - РНК-синтаза. После появления РНК-синтазы начинается репликация вирусной РНК. На первом этапе на (+) -цепи как на матрице образуется (-) цепь РНК, а на втором этапе (-) -цепь служит матрицей для синтеза (+) цепей РНК, идентичных вирусной.
2. Рабдовирусы (вирусы бешенства, Эбола, Марбурга) и парамиксовирусы (вирусы парагриппа, кори, паротита) имеют (-) -цепь РНК, которая не может прямо транслироваться в белок. Вместо трансляции эта (-) -РНК используется как матрица для транскрипции (+) -РНК. Транскрипция осуществляется РНК- синтазой, которая присутствует в вирусной частице. Синтезированная вирусная (+) -РНК дальше используется как матрица для рибосомального синтеза вирусных белков и как матрица для синтеза (репликации) (-) -цепи РНК идентичной вирусной.
3. (+-)-РНК (двухцепочечную РНК) имеют реовирусы, вызывающие респираторные инфекции. Принцип репродукции этих вирусов такой же как репликация двуцепочечной ДНК, но вместо ДНК-полимеразы функционирует РНК- полимераза (РНК-синтаза).

Второй путь идет при участии обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ревертазы). Он присущ ретровирусам (вирус иммунодефицита) и части онкогенных вирусов. Фермент катализирует последовательно три процесса:

• синтез (-) цепи ДНК на матрице вирусной (+) -РНК;
• разрушение вирусной РНК в составе образованного гибрида РНК-ДНК;
• синтез (+) –цепи ДНК на (-) -цепь ДНК с образованием двухцепочечной ДНК.

Эта ДНК из цитоплазмы проникает в ядро, интегрируется в геном хозяина и служит матрицей для синтеза вирусных РНК при участии РНК-полимеразной системы клетки-хозяина. Образованные вирусные РНК выходят в цитоплазму, где инициируют трансляцию вирусных белков. Из этих белков и РНК собираются вирусные частицы, которые способны инфицировать новые клетки.

Генетическую информацию, закодированную в отдельном гене, в общем можно рассматривать как инструкцию по производству определенного белка в клетке. Такая инструкция воспринимается клеткой только в том случае, если она послана в виде мРНК. Поэтому клетки, у которых генетический материал представлен ДНК, должны «переписать» (транскрибировать) эту информацию в комплементарную копию мРНК. ДНК-содержащие вирусы по способу репликации отличаются от РНК-содержащих вирусов.

ДНК обычно существует в виде двухцепочечных структур: две полинуклеотидные цепочки соединены водородными связями и закручены таким образом, что образуется двойная спираль. РНК, напротив, обычно существует в виде одноцепочечных структур. Однако геном отдельных вирусов представляет собой одноцепочечную ДНК или двухцепочечную РНК. Нити (цепочки) вирусной нуклеиновой кислоты, двойные или одинарные, могут иметь линейную форму или замыкаться в кольцо.

Первый этап репликации вирусов связан с проникновением вирусной нуклеиновой кислоты в клетку организма-хозяина. Этому процессу могут способствовать специальные ферменты, входящие в состав капсида или внешней оболочки вириона, причем оболочка остается снаружи клетки или вирион теряет ее сразу после проникновения внутрь клетки. Вирус находит подходящую для его размножения клетку, контактируя отдельными участками своего капсида (или внешней оболочки) со специфическими рецепторами на поверхности клетки по типу «ключ – замок». Если специфические («узнающие») рецепторы на поверхности клетки отсутствуют, то клетка не чувствительна к вирусной инфекции: вирус в нее не проникает.

Для того чтобы реализовать свою генетическую информацию, проникшая в клетку вирусная ДНК транскрибируется специальными ферментами в мРНК. Образовавшаяся мРНК перемещается к клеточным «фабрикам» синтеза белка – рибосомам, где она заменяет клеточные «послания» собственными «инструкциями» и транслируется (прочитывается), в результате чего синтезируются вирусные белки. Сама же вирусная ДНК многократно удваивается (дуплицируется) при участии другого набора ферментов, как вирусных, так и принадлежащих клетке.

Синтезированный белок, который используется для строительства капсида, и размноженная во многих копиях вирусная ДНК объединяются и формируют новые, «дочерние» вирионы. Сформированное вирусное потомство покидает использованную клетку и заражает новые: цикл репродукции вируса повторяется. Некоторые вирусы во время отпочковывания от поверхности клетки захватывают часть клеточной мембраны, в которую «заблаговременно» встроились вирусные белки, и таким образом приобретают оболочку. Что касается клетки-хозяина, то она в итоге оказывается поврежденной или даже полностью разрушенной. У некоторых ДНК-содержащих вирусов сам цикл репродукции в клетке не связан с немедленной репликацией вирусной ДНК; вместо этого вирусная ДНК встраивается (интегрируется) в ДНК клетки-хозяина. На этой стадии вирус как единое структурное образование исчезает: его геном становится частью генетического аппарата клетки и даже реплицируется в составе клеточной ДНК во время деления клетки. Однако впоследствии, иногда через много лет, вирус может появиться вновь – запускается механизм синтеза вирусных белков, которые, объединяясь с вирусной ДНК, формируют новые вирионы.

У некоторых РНК-содержащих вирусов геном (РНК) может непосредственно выполнять роль мРНК. Однако эта особенность характерна только для вирусов с «+» нитью РНК (т.е. с РНК, имеющей положительную полярность). У вирусов с «» нитью РНК последняя должна сначала «переписаться» в «+» нить; только после этого начинается синтез вирусных белков и происходит репликация вируса.

Так называемые ретровирусы содержат в качестве генома РНК и имеют необычный способ транскрипции генетического материала: вместо транскрипции ДНК в РНК, как это происходит в клетке и характерно для ДНК-содержащих вирусов, их РНК транскрибируется в ДНК. Двухцепочечная ДНК вируса затем встраивается в хромосомную ДНК клетки. На матрице такой вирусной ДНК синтезируется новая вирусная РНК, которая, как и другие, определяет синтез вирусных белков.

Основной функцией ДНК является ее способность к самоудвоению (репликации). Репликация - очень точный механизм, практически не допускающий ошибок. В самой ДНК (у некоторых вирусов - в РНК) закодирована информация о структуре ферментов, осуществляющих удвоение нуклеиновых кислот, синтез новых нуклеотидов - строительную базу репликации, исправление ошибок репликации, а также репарацию повреждений ДНК, вызванных разными факторами. Наконец, сама структура ДНК, а именно наличие двух цепей в ее составе, является условием, облегчающим процесс копирования, поскольку в таком случае каждая из цепочек может выполнять роль матрицы при синтезе новых молекул ДНК. Подобное предположение высказали Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик еще в 1953 г., и оно получило экспериментальное подтверждение. Такой механизм копирования ДНК, когда каждая из цепей выполняет функцию шаблона, а вновь синтезированные молекулы являются гибридными (состоят из одной старой и одной новой цепей), называется полуконсервативным .

Кроме полуконсервативной, были предложены еще две модели репликации: консервативная и дисперсивная . Особенности этих моделей репликации ДНК состоят в следующем. Согласно дисперсивной модели, родительская спираль ДНК при удвоении разрывается на каждом полуобороте путем множественной фрагментации, а синтез новых цепей происходит на фрагментах (рис. 1.9). По консервативной модели раскручивания спирали ДНК не происходит вовсе, и она служит матрицей для двух новых цепей, в результате чего родительская спираль целиком состоит из старого, а дочерняя - из нового материала. Доказательство реальности полуконсервативного механизма репликации ДНК предоставили Месельсон и Сталь в 1958 г. в экспериментах с ультрацентрифугированием меченой бактериальной ДНК.

Суть этих экспериментов состояла в следующем: ДНК E.coli метили радиоактивным изотопом 15 N, а затем давали осуществиться одному раунду репликации ДНК, выращивая клетки в течение ~ 50 мин на питательной среде, содержащей нормальный изотоп азота - 14 N. Выделенную из клеток ДНК подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия. При таком центрифугировании молекулы CsCl создают в пробирке градиент плотности, и молекулы других веществ распределяются в этом градиенте в соответствии со своей плотностью. ДНК E.coli, выращенных на среде, содержащей 15 N, имеет плотность 1,724 г/см 3 , тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом 14 N, характеризуется плотностью 1,710 г/см 3 . Таким образом, смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при центрифугировании по плотности. Локализацию ДНК в пробирке с градиентом CsCl можно определить по поглощению ультрафиолетовых лучей (ДНК поглощает излучение с длиной волны 260 нм). Таким образом, ДНК в пробирке выявляется в виде «полос» - «легкая» у верхнего края пробирки, «тяжелая» - ближе ко дну. В данном эксперименте в пробирке с градиентом хлористого цезия образовалась всего одна, средняя по «тяжести» полоса, положение которой соответствовало гибридной ДНК, включающей оба изотопа азота - 15 N и 14 N. Это обстоятельство исключало возможность реализации только одной модели репликации ДНК -консервативной. Для выбора между оставшимися двумя моделями репликации Месельсон и Сталь позволили бактериям, ДНК которых содержала оба изотопа, совершить еще одно деление на среде с 14 N. Затем их ДНК снова подвергли ультрацентрифугированию. На этот раз в пробирке сформировалось две полосы ДНК - «легкая» и средняя по «тяжести», что подтверждает справедливость полуконсервативного механизма репликации ДНК.

Итак, все изученные к настоящему времени способы репликации нуклеиновых кислот сводятся к полуконсервативному механизму, согласно которому после каждого раунда репликации одна нить в каждой из двух дочерних молекул является родительской, т. е. консервативной, а другая - синтезированной заново. Репликация одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот, представляющих геномы разных организмов, осуществляется с соблюдением определенных закономерностей при реализации разных механизмов, которые рассмотрены ниже. Общим для всех этих процессов является: 1) участие сложного комплекса ферментов, которые осуществляют репликацию; 2) наличие трех основных стадий процесса - инициации, элонгации и терминации; 3) соблюдение принципа комплементарности при построении новых цепей, при котором шаблоном (матрицей) служит родительская цепочка; 4) высокая точность процесса; 5) возможность исправления ошибок репликации в ходе корректорской правки .

Репликация двухцепочечных ДНК . Двухцепочечные ДНК формируют геномы всех клеточных организмов - и прокариот и эукариот. Наилучшим образом механизм репликации ДНК изучен по отношению к прокариотическим клеткам, в частности бактерий E.coli. В экспериментах с прокариотами показано, что в условиях, ограничивающих синтез белка, репликация ДНК не происходит, из чего можно сделать вывод, что этот процесс нуждается в участии белков. В настоящее время показано, что в процессе репликации ДНК участвуют продукты более чем 10 генов. Это, в первую очередь, ДНК-полимеразы , а также топоизомеразы , геликазы и лигазы . Появляется все больше данных в пользу участия в процессе репликации ДНК высокоорганизованного мультиферментного комплекса -реплисомы , включающей праймосомо-праймазный комплекс, геликазы, Pol III-холофермент и гиразы.

ДНК-полимеразы - это ключевые ферменты репликативного процесса, которые собственно и осуществляют наращивание полинуклеотидных цепей, используя принцип комплементарности. Наиболее полно изучены ДНК-полимеразы кишечной палочки. В клетках этих бактерий обнаружено три различных типа ДНК-полимераз (Pol-I, Pol-II и Pol-III), которые различаются в первую очередь скоростью катализа и нуклеазной активностью. ДНК-полимераза I (Pol-I) представляет собой одиночный полипептид, содержащий порядка 1000 аминокислотных остатков. В клетке E.coli насчитывается около 400 молекул этого фермента. Pol-I обладает следующими активностями: полимеразной - присоединение комплементарных матричной цепи дезоксинуклеотидов к свободной 3’-ОН-группе праймера в направлении от 5’- к 3’-концу (5’→3’) строящейся молекулы ДНК; экзонуклеазной - гидролиз фосфодиэфирных связей (отщепление нуклеотидов) в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, начиная с 3ў-конца цепи (3’→ 5’) и 5’-конца цепи (5’→3’). Экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E.coli. 3’→5’-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи (корректорская правка), а 5’→3’-экзонуклеазная активность используется для удаления димеров пиримидинов и рибонуклеотидов фрагментов Оказаки .

ДНК-полимераза II (Pol-II) присутствует в клетках кишечной палочки в значительно меньшем числе копий и осуществляет полимеразную активность гораздо медленнее, чем Pol-I (составляет только 5% активности ДНК-полимеразы I). В отличие от Pol-I этот фермент не обладает 5’→3’-экзонуклеазной активностью. Роль этой полимеразы в репликации до конца не выяснена. Считается, что этот фермент не обязателен для репликации ДНК, но может заменять отдельные функции Pol-I при ее повреждении.

ДНК-полимераза III (Pol-III) - основной фермент, ответственный за репликацию хромосомальной ДНК E.coli. В каждой клетке содержится только 10-20 молекул этого фермента, но работает он примерно в 60 раз быстрее ДНК-полимеразы I. Кроме того, Pol-III обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. Для данного фермента, так же как и для Pol-II, не присуща 5’→3’-экзонуклеазная активность. Поэтому для репликации отстающей цепи необходимо участие Pol-I, чтобы произошло удаление РНК-праймеров на 5’-конце фрагментов Оказаки.

В эукариотических клетках выявлено большее количество ДНК-полимераз, но их функции изучены хуже.

Функция топоизомераз сводится к разрешению механических и топологических проблем в процессе раскручивания двойной спирали в репликативной вилке. Эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и приводят к образованию «шарнира», который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки. В различных организмах идентифицированы топоизомеразы двух основных типов: топоизомеразы типа I надрезают одну из двух цепей, в результате чего концевой участок двойной спирали может повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, изменяют степень сверхспирализации, а затем соединяют разорванные концы.

Геликазы осуществляют образование и продвижение вдоль спирали ДНК репликативной вилки - участка молекулы с расплетенными цепями. Эти ферменты используют для расплетения цепей энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР. Для обеспечения более высокой скорости раскручивания несколько геликаз действуют в комплексе с белками второго типа, которые связываются с одноцепочечными участками молекулы и тем самым стабилизируют расплетенный дуплекс .

Наконец, ДНК-лигазы катализируют процессы воссоединения фрагментов цепей ДНК, участвуя в образовании ковалентных связей (фосфодиэфирных мостиков) между 5’-P- и 3’-ОН-группами соседних дезоксирибонуклеотидов. Эти ферменты также используют энергию макроэргических связей, образующуюся при гидролизе АТР или GTP.

Механизм репликации двухцепочечной ДНК лучше всего исследован для бактерий E.coli и будет рассмотрен на данном примере. Инициация репликации Д НК. Процесс репликации ДНК кишечной палочки начинается в строго определенной точке, которая называется origin (ori), или точкой начала репликации, и расположена на 85 мин. генетической карты хромосомы этих бактерий. В ori репликации на ДНК действуют ферменты (топоизомеразы, геликазы), обусловливающие формирование репликативной вилки, в которой собственно и происходит копирование цепей. Для репликации необходимо наличие: ДНК-матрицы в виде одноцепочечного участка ДНК, смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, реплисомы (ансамбля ферментов, принимающих участие в репликации) и 3’-ОН–группы нуклеиновой кислоты -затравки, к которой ДНК-полимераза должна присоединять следующий нуклеотид. Дело в том, что ни одна из ДНК-полимераз не может начинать процесс полимеризации нуклеотидов de novo. Эту функцию выполняют РНК-полимеразы, которые узнают ori репликации в репликативной вилке и синтезируют коротенькие (10-60 рибонуклеотидов) последовательности - РНК-затравки (праймеры). При этом синтез затравок осуществляется в направлении от 5’- к 3’-концу, и в результате образуется свободный 3’-ОН-конец, который может использовать ДНК-полимераза для продолжения процесса полимеризации цепей на стадии элонгации репликации (рис. 1.10).

Элонгация репликации ДНК. Синтез новых цепей ДНК осуществляется с соблюдением принципа комплементарности: каждый подбираемый в растущую цепь нуклеотид должен быть комплементарен соответствующему (расположенному напротив) нуклеотиду в исходной (матричной) цепи.

Поскольку все ДНК-полимеразы осуществляют процесс полимеризации нуклеотидов только в одном направлении (5’→3’), а репликативная вилка движется вдоль ДНК в обоих направлениях, непрерывно синтезироваться в каждом из направлений может лишь одна нить, которую называют лидирующей . Вторая (противоположная) нить синтезируется короткими фрагментами (фрагменты Оказаки) и называется отстающей (рис. 1.10). Фрагменты Оказаки у прокариот содержат порядка 1000 нуклеотидов, а у эукариот - 100-200 нуклеотидов.

Кроме полимеризации цепей, которую осуществляет в основном ДНК-полимераза III, в процессе репликации ДНК происходят следующие события:

Вырезание РНК-затравок из лидирующей цепи и из каждого фрагмента Оказаки. Эту функцию выполняет Pol-I с помощью своей 5’→3’-экзонуклеазной активности;

Заполнение “брешей”, оставшихся после вырезания РНК-затравок. Эту работу также осуществляет ДНК-полимераза I, используя свободную 3’-ОН–группу соседнего фрагмента Оказаки;

Соединение фрагментов ДНК в отстающей цепи с помощью фермента ДНК-лигазы: когда растущий 3’-гидроксильный конец каждого фрагмента Оказаки доходит до 5’-дезоксинуклеотидного конца соседнего фрагмента, вступает в действие ДНК-лигаза и образуется непрерывная отстающая цепь;

Исправление ошибок репликации - корректорская правка. Этот механизм характерен как для Pol-I, так и для Pol-III и основывается на их 3’→5’-экзонуклеазной активности. Известно, что ДНК-полимераза проверяет комплементарность подбираемого нуклеотида, контролируя размер новой предполагаемой пары нуклеотидов в своем активном центре, и ее полимеразная активность включается лишь тогда, когда эта комплементарность установлена. С другой стороны, каждый вновь встроенный нуклеотид также проверяется на соответствие своей паре в активном центре фермента. Если размер образовавшейся пары нуклеотидов не соответствует истинному (когда основания противоположных нуклеотидов не комплементарны друг другу), с помощью своей 3’→5’-экзонуклеазной активности фермент вырезает некомплементарный нуклеотид и ищет ему замену. Дополнительным механизмом, уменьшающим ошибки репликации, служит репарация ДНК. В результате частота ошибочного включения нуклеотидов в образующуюся при репликации цепь ДНК крайне низка (10 -8 -10 -10).

Терминaция репликации. При двунаправленной репликации кольцевого генома (как у кишечной палочки) репликативные вилки встречаются на расстоянии 180° от точки репликации, и в этом месте репликация завершается. Кольцевые ДНК в месте встречи соединяются лигазой, при этом они оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем происходит их разделение на отдельные геномы с помощью топоизомеразы типа II.

Скорость репликации ДНК у бактерий E.coli составляет примерно 1500 пар нуклеотидов в секунду. Таким образом, полный геном кишечной палочки (4*10 6 п. н.) реплицируется примерно за 40 мин. Однако клетки E.coli делятся быстрее - каждые 20 мин, и это означает, что при прежней скорости копирования увеличивается частота актов инициации в той же самой точке начала репликации. Т. е. еще до завершения первого раунда репликации генома в сайте ori инициируется второй раунд репликации. Скорость движения репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше (10-100 п.н. в секунду), но завершение репликации в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. В результате хромосома дрозофилы, например, содержащая 6,5*10 7 п.н., реплицируется за несколько минут.

В целом закономерности репликации, выявленные для прокариот, характерны и для большинства эукариотических геномов. Отличия состоят, в первую очередь, в наличии у эукариот множества сайтов инициации репликации на каждой хромосоме, иных, чем у прокариот, механизмах исправления ошибок репликации, а также в ферментативном оснащении процесса репликации. Схематическое изображение процессов репликации циклических, формирующих геномы прокариот и плазмид, и линейных (эукариотических) геномов представлены на рис. 1.11.

В линейной ДНК раскручивание цепей осуществляется путем вращения одной цепи вокруг другой. В кольцевой ДНК раскручивание и репликация ведут к образованию структуры, напоминающей кольцо с внутренней петлей. Ее называют тэта-петлей , поскольку по форме она похожа на греческую букву Q. Такие петли можно наблюдать на радиоавтографах реплицирующихся бактериальных ДНК, что впервые осуществил Кэрнс для ДНК E.coli. Приведенный механизм двунаправленной репликации ДНК является наиболее распространенным, но не единственным. ДНК фагов Р22, 186, Р2, а также фагов Т4 и l на поздних стадиях литического цикла реплицируется по однонаправленному механизму (тип катящегося кольца ). В этом случае двухцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца). Образовавшийся в результате надреза 5’-конец цепи связывается с ферментом, осуществившим надрез. Синтез ДНК начинается с вытеснения 5’-конца, связанного с ферментом, в раствор, что позволяет ДНК-полимеразе присоединять нуклеотиды к 3’-ОН-концу. Происходит полуконсервативная репликация, в ходе которой 5’-конец разорванной цепи вытесняется в виде свободного хвоста и его длина все увеличивается, а матрицей служит интактная замкнутая цепь. Эту реплицирующуюся структуру (рис. 1.12) называют катящимся кольцом, так как разматывание свободной одиночной цепи сопровождается вращением двухцепочечной матрицы вокруг своей оси.

Если этот механизм используется для репликации двухцепочечной ДНК, то 5’-концевые хвосты служат матрицами для синтеза небольших фрагментов ДНК, которые сразу же сшиваются вместе под действием ДНК-лигазы. В результате растущие хвосты вскоре после своего образования приобретают двухцепочечную структуру. Элонгация хвостов приводит иногда к

тому, что их длина многократно превышает общую длину исходной кольцевой молекулы. Такой способ репликации использует, например, фаг l. При упаковке ДНК в капсиды в специальных участках, называемых cos-сайтами и отстоящих друг от друга на длину вирусного генома, образуются надрезы, в результате чего длинные дуплексы многократно повторенной фаговой ДНК расчленяются на фрагменты, соответствующие по размерам зрелой ДНК, обнаруживаемой в вирионах бактериофага l. Репликация по типу катящегося кольца характерна также для образования копии бактериальной хромосомы E.coli Hfr и фактора F + , передающихся при конъюгации в реципиентную клетку.

Репликация одноцепочечных ДНК . У фагов М13 или fХ174, чьи зрелые геномы представлены одиночными кольцевыми ДНК, репликация осуществляется по механизму катящегося кольца (рис. 1.12). Это происходит на поздних стадиях инфекционного процесса, после того, как

инфицирующая ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. В данном случае не осуществляется репликация 5’-концевых участков, в отличие от репликации геномов фага l (рис. 1.12, поз. 5), поэтому продуктом репликации являются длинные одиночные цепи ДНК, постоянно отделяющиеся от «катящегося рулона» Эти цепи надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых кольцевых форм, упаковываемых в капсиды.

Репликация РНК. Образование РНК-содержащих вирусов происходит путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в результате транскрипции ДНК. За исключением ретровирусов репликация РНК в основном повторяет процесс репликации ДНК. Как и при репликации ДНК, порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копированием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуществляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами . РНК бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис, инфицирующих животных, всегда обозначается знаком (+), поскольку последовательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков. Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клетки-хозяина и инициирует процесс копирования (+)-цепи с ее 3’-конца с образованием полной (-)-цепи, ассоциированной с (+)-цепью-матрицей. Затем та же репликаза синтезирует множество копий (+)-цепи РНК, используя новосинтезированную (-)-цепь в качестве матрицы. Геномы некоторых вирусов (вирус везикулярного стоматита, гриппа) представлены одной или несколькими (-)-цепями. В этом случае они служат матрицами для синтеза (+)-цепей, которые играют роль мРНК и используются при синтезе дочерних (-)-цепей.

Отличительной особенностью репликации геномов ретровирусов является то, что после проникновения их РНК в клетку хозяина вирусный геном подвергается обратной транскрипции. При этом сначала образуется дуплекс РНК-ДНК, а затем - двухцепочечная ДНК. Фермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной траскриптазой (ревертазой ). Он содержится в ретровирусных частицах (вирионах) и активируется после попадания в клетку. Появляется все больше данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эукариотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестройки генома. Репликация двухцепочечной формы ретровирусной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК. Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен. После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интегрированных копий вирусной ДНК.

Играют роль матриц . Новая цепь, синтезирующаяся на каждой из исходных цепей, идентична др. исходной цепи. Когда процесс завершается, образуются две идентичные двойные спирали , каждая из к-рых состоит из одной старой (исходной) и одной новой цепи (рис. 1). Таким образом от одного поколения к другому передается только одна из двух цепей, составляющих исходную молекулу ДНК ,-т. наз. полуконсервативный механизм репликации.

Репликация состоит из большого числа последоват. этапов, к-рые включают узнавание точки началу репликации, расплетание исходного дуплекса (спирали), удержание его цепей в изолированном друг от друга состоянии, инициацию синтеза на них новых дочерних цепей, их рост (элонгацию), закручивание цепей в спираль и терминацию (окончание) синтеза. Все эти этапы репликации, протекающие с высокой скоростью и исключит. точностью, обеспечивает комплекс, состоящий более чем из 20 ферментов и белков ,-т. наз. ДНК-репликазная система, или реплисома. Функцион. единица репликации-реплик он, представляющий собой сегмент (участок) хромосомы или внехромосомной ДНК , ограниченный точкой начала, в к-рой инициируется репликация, и точкой окончания, в к-рой репликация останавливается. Скорость репликации контролируется на стадии инициации. Однажды начавшись, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован (удвоен). Частотд инициации определяется взаимод. спец. регуляторных белков с точкой начала репликации. Бактериальные хромосомы содержат один репликон: инициации в единств. точке начала репликации ведет к репликации всего генома . В каждом клеточном цикле репликация инициируется только один раз, Плазмиды и вирусы , являющиеся автономными генетич. элементами, представляют собой отдельные репликоны, способные к многократной инициации в клетке-хозяине. Эукариотич. хромосомы (хромосомы всех организмов , за исключением бактерий и синезеленых водорослей) содержат большое число репликонов, каждый из к-рых также однократно инициируется за один клеточный цикл .

Рис. 1. Схема полуконсервативного механизма репликации: А, Т, G и С-остатки пуриновых и пиримидиновых оснований (соотв. аденина , тимина , гуанина и цитозина); 1 -исходная цепь ДНК ; 2-новая цепь ДНК .

Начиная с точки инициации, репликация осуществляется в ограни-ченной зоне, перемещающейся вдоль исходной спирали ДНК . Эта активная зона репликации (т. наз. репликац. вилка) может двигаться в обоих направлениях. При однонаправленной репликации вдоль ДНК движется одна репликац. вилка. При двунаправленной репликации от точки инициации в противоположных направлениях расходятся две репликац. вилки; скорости их движения могут различаться. При репликации ДНК бактерии и млекопитающих скорость роста дочерней цепи составляет соотв. 500 и 50 нуклеотидов в 1 с; у растений эта величина не превышает 20 нуклеотидов в 1 с. Движение двух вилок в противоположных направлениях создает петлю, к-рая имеет вид "пузыря" или "глаза". Продолжающаяся репликация расширяет "глаз" до тех пор, пока он не включит в себя весь репликон.

В ходе репликации рост цепи осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с 3"-ОН концевым ну-клеотидом уже построенной части ДНК ; при этом отщепляется пирофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З"-конца, т. е. в направлении 5" : 3" (см. Нуклеиновые кисло-ты). Фермент , катализирующий эту р-цию,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-не способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК , если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз. затравочного олигонуклеотида) комплементарного матрице ; затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК , а РНК .

Рис. 2. Направление роста дезоксирибонуклеотидных цепей при репликации; сплош ные линии - исходная ДНК , пунктирные - новые цепи ДНК (стрелки показывают на правлениеих роста); 1-репликац. вилка.

Энергия, затрачиваемая на образование каждой новой фосфодиэфирной связи в цепи ДНК , обеспечивается расщеплением фосфатной связи между a - и b -фосфатными группами нуклеозидтрифосфата.

ДНК-полимераза имеет один центр связывания нуклеозидтрифосфата, общий для всех четырех нуклеотидов . Выбор из среды нуклеотида , основание к-рого комплементарно очередному основанию матрицы , протекает без ошибок, благодаря определяющему влиянию ДНК-матрицы (исходной цепи ДНК). При нек-рых мутационных повреждениях структуры ДНК-полимеразы в ряде случаев происходит включение некомплементарных нуклеотидов .

В процессе репликации формальной ДНК на короткое время с вероятностью 10 -4 -10 -5 возникают редкие таутомерные формы всех 4 азотистых оснований нуклеотидов , к-рые образуют неправильные пары . Высокая точность репликации (вероятность ошибок не превышает 10 -9) обусловлена наличием механизмов, осуществляющих коррекцию (репарацию).

Репликац. вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, а другая-с перерывами. Первую наз. ведущей, или лидирующей, цепью, а вторую-отстающей. Синтез второй цепи идет медленнее; хотя в целом эта цепь строится в направлении 3" : 5", каждый из ее фрагментов в отдельности наращивается в направлении 5" : 3" (рис. 3). Благодаря такому прерывистому механизму синтеза, репликация обеих антипараллельных цепей осуществляется с участием одного фермента-ДНК-полимеразы, катализирующего наращивание нуклеотидной цепи только в направлении 5" : 3".

Рис. 3. Схема механизма роста цепей ДНК при репликации: А-ведущая цепь, Б-отстающая цепь, В-фрагмент Оказаки.

В качестве затравок для синтеза фрагментов отстающей цепи служат короткие отрезки РНК , комплементарные матричной цепи ДНК . Эти РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов , с определенными интервалами синтезируются на матрице отстающей цепи из рибонуклеозидтрифосфатов в направлении 5" : 3" с помощью фермента РНК-праймазы. РНК-праймеры затем наращиваются дезоксинуклеотидами с 3"-конца ДНК-поли-меразой, к-рая продолжает наращивание до тех пор, пока строящаяся цепь не достигает РНК-затравки, присоединенной к 5"-концу предыдущего фрагмента. Образующиеся таким образом фрагменты (т. наз. фрагменты Оказаки) отстающей цепи насчитывают у бактерий 1000-2000 дез-оксирибонуклеотидных остатков; в животных клетках их длина не превышает 200 нуклеотидов .

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК , удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК . У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5" : 3"-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З"-конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З"-ОН нового фрагмента ДНК и 5"-фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамид-адениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов).

Раскручивание двойной спирали и пространств. разделение цепей осуществляется при помощи неск. спец. белков . Т. наз. геликазы расплетают короткие участки ДНК , находящиеся непосредственно перед репликац. вилкой. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ до аденозиндифосфата и фосфата . К каждой из разделившихся цепей присоединяется неск. молекул ДНК-связывающих белков , к-рые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному воссоединению цепей. Благодаря этому нуклеотидные последовательности цепей ДНК оказываются доступными для репликативной системы. Др. специфич. белки помогают праймазе получить доступ к матрице отстающей цепи. В результате праймаза связывается с ДНК и синтезирует РНК-затравки для фрагментов отстающей цепи. Для формирования новых спира-,лей не требуется ни затрат энергии, ни участия к.-л. "закручивающего" фермента .

В случае кольцевого репликона (напр., у плазмиды) описанный процесс наз. q -репликацией. Т.к. кольцевые молекулы ДНК закручены сами на себя (суперспирализо-ваны), при раскручивании двойной спирали в процессе репликации они должны непрерывно вращаться вокруг собств. оси. При этом возникает торсионное напряжение, к-рое устраняется путем разрыва одной из цепей. Затем оба конца сразу же вновь соединяются друг с другом. Эту ф-цию выполняет фермент ДНК-топоизомераза. Репликация в этом случае обычно происходит в двух направлениях, т.е. существуют две репликац. вилки (рис. 4). После завершения репликации появляются две двухцепочечные молекулы , к-рые сначала связаны друг с другом как звенья одной цепи. При их разделении одно из двух колец временно разрывается.

Рис. 4. Один из механизмов репликации плазмиды (начало репликации обозначено точками); направления движения репликац. вилки показаны стрелками, образующиеся новые цепи ДНК-пунктиром.