Конфокальные микроскопы. Kонфокальная лазерная сканирующая микроскопия Конфокальный микроскоп принцип

В этой книге в краткой форме изложен материал, необходимый для освоения современных методов конфокальной лазерной микроскопии. Часть из описанных в тексте практических приемов разработана и усовершенствована авторами издания. Отличительной особенностью данной книги является сочетание ключевых моментов из теории современных методов микроскопии с примерами использования различных приемов конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии на практике. В приложениях приводятся необходимые сведения о спектральных характеристиках флуорохромов и протоколы иммуноцитохимических реакций, использованных авторами для получения изображений препаратов и построения трехмерных реконструкций микроскопических объектов. Настоящее руководство может являться справочным пособием для специалистов, применяющих в своей работе флуоресцентные методы и конфокальную микроскопию, а также будет полезно для студентов биологических и медицинских факультетов, изучающих морфологические и нейробиологические дисциплины.

* * *

компанией ЛитРес .

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием метода фазового контраста, для двулучепреломляющих материалов применяют поляризационный контраст. Основным же методом контрастирования в биологии является окрашивание препаратов веществами, способными связываться с препаратом и поглощать свет или флуоресцировать. Последние называют флуорохромами.

1.1. Основные понятия

Флуорохромы (флуоресцентные красители)1 – это вещества, которые способны связываться с объектом и расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию. Под флуоресценцией понимают способность ряда веществ после поглощения света с одной длиной волны излучать свет с другой длиной волны. Напомним, что электроны в атомах расположены на энергетических уровнях; расстояние между уровнями является характеристикой молекулы. При облучении вещества светом возможен переход электронов на более высокий энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света связаны между собой уравнением Бора (постулат Бора):

где ΔЕ – разность энергий между уровнями; v – частота; λ – длина волны; h – постоянная Планка; с – скорость света.

После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в виде тепла, а часть может быть излучена в виде фотона. Согласно правилу Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого, или, другими словами, максимум спектра излучения сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн. С физическими основами описанных выше процессов более подробно можно ознакомиться в учебнике Р. Фейнмана (2011).

Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания. Например, один из самых распространенных флуоресцентных красителей – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – имеет максимум поглощения l ex = 492 нм, а максимум излучения для него составляет l em = 518 нм. Другой распространенный флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), имеет l ex = 543 нм и l em = 570 нм. На величину стоксова сдвига также влияет полярность среды, в которой находится флуорохром.

Наиболее интенсивной флуоресценции флуорохрома можно добиться, облучая его светом с длиной волны, близкой к максимуму поглощения, однако возможно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при облучении его светом с длиной волны, существенно отличающейся от его максимума поглощения. Например, флуорофор можно перевести в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами (мультифотонное возбуждение), что будет эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Так, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм.

Еще одной характеристикой флуорохрома является квантовый выход – отношение интенсивности поглощаемого и испускаемого света. Квантовый выход (Q ) может быть выражен через отношение интенсивности флуоресценции (F ) к разности интенсивностей падающего (I 0) и выходящего (I ) световых потоков:

Заметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за «стоксовских» потерь. В зависимости от квантового выхода флуорохромы разделяют на слабые и сильные. Современные синтетические флуорохромы, как правило, обладают высоким квантовым выходом и являются сильными.

Для характеристики способности флуорохрома поглощать свет определенной длины волны вводят понятие молярного коэффициента экстинкции, который определяется как оптическая плотность одномолярного раствора вещества при толщине светопоглощающе-

го слоя в 1 см. Молярный коэффициент поглощения имеет размерность л ⋅ моль - 1 ⋅ см - 1 . Он зависит от природы вещества и от длины волны проходящего света. Величина, полученная путем перемножения молярного коэффициента экстинкции на величину квантового выхода, характеризует яркость флуоресценции флуорохрома при заданной длине волны. Время облучения, при котором флуорохром теряет 50 % яркости, называют фотостабильностью. «Идеальный» флуорохром должен иметь высокий квантовый выход и хорошую фотостабильность. Современные флуорохромы на основе полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) по этим показателям на порядок превосходят органические соединения (Олейников В. А., 2011).

Еще один важный параметр - время жизни возбужденного состояния , которое определяется как среднее время нахождения молекулы в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Время затухания флуоресценции флуорохрома (τ) описывается формулой:

где Г – константа скорости излучательной дезактивации флуорофора; k – обобщенная константа скорости безызлучательной дезактивации.

Обычно время затухания флуоресценции составляет около 10 нс.

Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может приводить множество процессов: химические реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов, тушение при столкновениях. К тушению флуоресценции относятся также процессы кажущегося тушения, которое обусловлено оптическими свойствами образца (высокая оптическая плотность, мутность). Для тушения флуоресценции требуется контакт между молекулами флуорохрома и тушителя. Если тушитель диффундирует к флуорохрому, пока последний находится в возбужденном состоянии, и в результате контакта флуорохром возвращается в основное состояние без излучения фотона, говорят о динамическом тушении. Статическое тушение происходит при образовании нефлуоресцирующего комплекса между флуорохромом и тушителем. При увеличении концентрации флуорохрома возможно самотушение флуоресценции как результат поглощения молекулами вещества собственного излучения. Возможно также поглощение флуоресцентного излучения одного флуорохрома другим. К тушителям флуоресценции относят молекулярный кислород, ароматические и алифатические амины, ксенон, пероксид водорода, акриламид, оксид азота, нитрометан, нитроксиды, хлороформ, трихлорэтанол, бромбензол. Следует отметить, что не все флуорохромы тушатся любыми из вышеперечисленных веществ, однако (в зависимости от условий эксперимента) почти всегда можно подобрать эффективную пару флуорохром-тушитель или, напротив, избежать тушения флуоресценции (что более важно в морфологических исследованиях).

Для флуорохромов характерна анизотропия флуоресценции . Анизотропия – это зависимость свойств вещества от направления. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются только те молекулы флуорохрома, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего излучения. Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуорохромов приводит к частично поляризованному испусканию флуоресценции. В общем случае анизотропия флуоресценции r выражается формулой:

где Iv и Ih – интенсивности флуоресценции вертикально и горизонтально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.

При планировании экспериментов с использованием флуорохромов, особенно флуорохромов нового поколения – квантовых точек – необходимо учитывать возможность мерцания флуоресценции. Это стохастический процесс перехода флуорохрома из флуоресцирующего состояния в состояние отсутствия флуоресценции, несмотря на постоянное возбуждение. В результате, при наблюдении за одиночными флуоресцирующими комплексами возникает стробоскопический эффект (зрительная иллюзия неподвижности или мнимого движения предмета при его прерывистом наблюдении). Кроме этого, поскольку время нахождения флуорохрома во «включенном» и «выключенном» состоянии является случайным, сравнение результатов независимых экспериментов при использовании таких флуорохромов затруднено. При конфокальной микроскопии данный эффект может быть компенсирован за счет линейного или покадрового усреднения сканируемых изображений.

1.2. Устройство флуоресцентного микроскопа

Прототип флуоресцентного микроскопа был разработан в начале ХХ в. Августом Келлером, который при конструировании микроскопа использовал в качестве источника света дуговую кадмиевую лампу. Затем немецкий физик Генри Фридрих Зидентопф, работая в оптических мастерских Цейса (в 1907 – 1938 гг. директор лаборатории микроскопии), совместно с Рихардом Зигмонди изобрел (1903) щелевой ультрамикроскоп. Еще через восемь лет (1911) Oskar Heimstдdt сконструировал первый флуоресцентный микроскоп и применил его для исследования явления автофлуоресценции органических и неорганических объектов. Однако в то время было трудно добиться эффективного разделения флуоресцентного сигнала от возбуждающего света. Эта проблема была преодолена Philipp Ellinger и August Hirt в 1929 г., которым удалось разработать так называемый эпифлуоресцентный микроскоп. В предложенной ими конфигурации микроскопа освещение препарата и детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась с одной стороны от образца, поэтому объектива достигал только отраженный возбуждающий и излучаемый свет. Прорыв в развитии флуоресцентной микроскопии связан с появлением лазеров (60-е гг. XX в.), с помощью которых удалось добиться высокой степени пространственной и временной когерентности светового пучка. Кроме того, стало возможным эффективно разделять сигналы, используя дихроичные зеркала.

Принципиальная схема современного флуоресцентного микроскопа представлена на рис. 1.

Свет от источника проходит через фильтр возбуждающего излучения. При этом из спектра выделяются только те компоненты, которые необходимы для возбуждения флуоресценции. Затем свет попадает на дихроичное зеркало (светоделитель). Отраженный светоделителем свет попадает в объектив флуоресцентного микроскопа и фокусируется на образце, возбуждая флуоресценцию. Флуоресцентный сигнал (смещенный в длинноволновую область (согласно Правилу Стокса)) , а также рассеянное излучение возбуждения достигает светоделителя, но, в отличие от возбуждающего света, проходит через дихроичное зеркало, после чего рассеянное излучение отсеивается эмиссионным фильтром и на детектор попадает только излучение флуоресценции.

Источник возбуждающего света. В настоящее время используются три типа источников света: лампы высокой мощности (ртутные, ксеноновые и их аналоги), диоды и лазеры. Ртутная лампа – это газоразрядный источник света, в котором при электрическом разряде в парах ртути под высоким давлением возникает оптическое излучение преимущественно в ультрафиолетовой области спектра. Такие источники света являются малоэффективными, поскольку они производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии по сравнению с энергией, требуемой для возбуждения флуоресценции. Флуоресцентные микроскопы могут быть укомплектованы ртутными лампами мощностью 50 – 200 W. Использование более мощной лампы позволяет возбудить с достаточной эффективностью даже слабый флуорохром, но при этом необходимо учитывать, что увеличение мощности лампы влечет за собой увеличение скорости выгорания флуорохромов.

Рис. 1. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа

В ксеноновой лампе вспышка происходит после ионизации газа и прохождении через него мощного импульса электрического тока, поданного на поджигающий электрод. В результате этого электроны в молекуле ксенона занимают орбиты с более высокими энергетическими уровнями и, возвращаясь на прежние орбиты, излучают энергию в виде фотонов. Ксеноновая лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, что не всегда пригодно для возбуждения флуоресценции. Такие лампы обычно используют при работе с флуорохромами, требующими для возбуждения длинноволновый свет (красной и инфракрасной области).

Вместо ртутной или ксеноновой лампы можно использовать металлогалогенную лампу (metal halide lamp ). Это газоразрядная лампа высокого давления. Внутри колбы размещается кварцевая или керамическая цилиндрическая горелка, в которой находятся галогениды некоторых металлов (йодиды натрия, таллия, индия и др.), инертный газ (преимущественно ксенон и аргон) и металлическая ртуть. При подаче на лампу питающего напряжения происходит зажигание дугового разряда, металл начинает испаряться, его атомы возбуждаются, что приводит к возникновению излучения. В зависимости от состава металлов различаются и спектры излучения ламп. Обычно компоненты подбираются так, чтобы компенсировать недостаток красного и желтого света в спектре ртути, что немаловажно при использовании возбуждаемых светом этого диапазона флуорохромов (например, флуоресцеина). Кроме этого, лампы данного типа компактны, экономичны в использовании, для них характерен пониженный уровень тепловой отдачи.

Источник возбуждения флуоресцентного излучения может быть выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, причем возможно использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную. Применение светодиодов позволяет избежать нагревания системы, увеличивает срок ее эксплуатации.

Лазеры в качестве источника света используются в основном в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. В таких микроскопах остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Поскольку лазеры испускают свет в узкой спектральной области, пропадает необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на разных длинах волн, требуется применять разные лазеры или же прибегать к различного рода приемам.

Фильтры.

Фильтр возбуждающего света подбирается таким образом, чтобы он выделял из спектра лампы свет той длины волны, которая максимально эффективно поглощается флуорохромом. Например, выпускаются светофильтры под стандартные флуорохромы для «синей», «зеленой», «красной» люминесценции или под несколько стандартных флуорохромов (например, возбуждающий светофильтр BP 560/40 нм для «красной» люминесценции или возбуждающий светофильтр под несколько флуорохромов BP 370/40, BP 474/28, BP 585/35 нм производства фирмы Carl Zeiss).

Дихроичные зеркала (интерференционные светофильтры) имеют специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускать излучение с большей длиной волны. В данном случае возбуждающее излучение отражается, а сигнал флуоресценции полностью пропускается. Для получения таких фильтров на поверхность прозрачной пластины наносят несколько (от 10 до 200) слоев материала с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Например, PbCl2, TiO2, ZnS (показатель 2,2 – 2,3) и MgF 2 , SiO 2 , Na 3 AlF 6 (показатель 1,3 – 1,4). Толщина каждого слоя тщательно выдерживается (используется техника вакуумного напыления), поскольку этот параметр определяет положение максимума кривой пропускания. От числа слоев зависит ширина зоны пропускания фильтра и степень подавления «ненужной» части спектра.

Запирающие фильтры (band pass BP). При конструировании запирающих фильтров используют комбинацию длинноволновых отрезающих (shot pass filter, или SP filter) и длинноволновых пропускающих (long pass filter, или LP filter) фильтров. Первые задерживают длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP-фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Комбинируя эти фильтры, можно добиться того, что через фильтр будет проходить только свет определенного участка спектра. Запирающий фильтр выбирают в соответствии с фильтром возбуждающего света. Например, при установке возбуждающего светофильтра BP 560/40 нм используют запирающий светофильтр BP 630/75 нм.

Сближение в пространстве всех светофильтров позволило объединить их в единый светоделительный модуль. Такая конструкция обеспечивает производство легкой замены или смены модуля и дает возможность применять несколько флуорохромов одновременно, с высокой точностью совмещая полученные изображения. При приобретении флуоресцентного микроскопа необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светоделительных модулей, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся флуорохромов. Если планируется использовать несколько флуоресцентных красителей, необходимо учитывать, что спектры излучения флуорохромов не должны перекрываться. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных.

Детекторы флуоресцентного сигнала. Усиление и детектирование сигнала производится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и цифровой видеокамеры. ФЭУ – это электровакуумный прибор, в котором поток электронов, излучаемый фотокатодом, усиливается в умножительной системе в результате вторичной электронной эмиссии. В результате фотоэффекта при попадании фотона на фотокатод из него вылетают электроны, которые, ускоряясь в электрическом поле, направляются на систему динодов (специальный электрод), где за счет вторичной электронной эмиссии образуют нарастающую (от динода к диноду) электронную лавину, поступающую на анод. Обычно коэффициент усиления ФЭУ (число электронов, достигших анода при выбивании из фотокатода одного электрона) составляет около 10 6 , что позволяет получить на выходе ФЭУ легко регистрируемый сигнал.

Цифровые камеры в качестве светочувствительного элемента имеют CCD-матрицу (charge-coupled device), она же ПЗС-матрица (сокр. от «прибор с зарядовой связью»). CCD-матрица является специализированной интегральной аналоговой микросхемой, которая представляет собой набор резисторов. Количество этих ячеек (элементов) в матрице является основной определяющей разрешения и качества картинки. Принцип работы CCD-матрицы следующий: свет, попавший на матричные элементы, преобразуется в электрический заряд, формируется зарядовая картина, которая пропорциональна освещенности в каждой ячейке. Матрица может «накапливать» заряды в течение определенного периода времени. Общий заряд, накопленный в ячейке, равен произведению зарядов на время экспонирования. Для получения цветной картинки, как правило, световой луч еще проходит через набор специальных светофильтров/призм зеленого, синего и красного цвета. С более подробным описанием принципов работы отдельных модулей флуоресцентного микроскопа можно ознакомиться в пособии В. И. Голышевской [и др.] (2008) и в работе H. C. Ishikawa-Ankerhold (2012).

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).

В современном конфокальном микроскопе источником возбуждающего света является лазер. Преимуществом лазеров по сравнению с ламповыми источниками света заключается в монохроматичности генерируемого света и малой расходимости светового пучка. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце. На рис. 2 показана принципиальная схема современного лазерного конфокального микроскопа.

Лазер излучает свет, формируя узкий световой пучок. Затем свет проходит через систему линз (расширитель пучка) и попадает на светоделитель, который отражает возбуждающий свет, направляя его на систему зеркал (на схеме не показана), позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Светоделитель обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти стопроцентное пропускание света в остальном спектральном диапазоне. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. При этом лазерный луч может возбуждать флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит, а интенсивность флуоресценции будет возрастать по мере приближения к точке фокусировки. Флуоресцентное излучение собирается объективом и возвращается на светоделитель, проходит сквозь него, попадая на эмиссионные фильтры. Отраженное излучение лазера через светоделитель не проходит. При необходимости многоканальной регистрации (например, при использовании нескольких флуорохромов) возможно дополнительное деление флуоресцентного сигнала на составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Собранный из определенной точки образца свет фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole), попадает на детектор (ФЭУ) и оцифровывается. При этом свет, исходящий из областей, находящихся выше или ниже плоскости фокуса, отсекается диафрагмой и на детектор не попадает. После регистрации флуоресцентного сигнала от первой точки фокусировки при помощи системы зеркал луч возбуждающего света перемещается на следующую точку в образце. Весь процесс повторяется. Так, точка за точкой, формируется изображение в горизонтальной (или вертикальной) плоскости.

Рис. 2. Принципиальная схема простейшего конфокального микроскопа

Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым изменяя толщину оптического слоя, от которого регистрируется сигнал. Однако следует понимать, что уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы (а, следовательно, и уменьшение толщины оптического слоя) приводит к снижению интенсивности света, который диафрагма пропускает к детектору и, соответственно ухудшению детекции объектов с неяркой флуоресценцией. В связи с этим приходится искать компромисс между разрешением по оси z , зависящим от размера конфокальной диафрагмы, и возможностью регистрации четких флуоресцирующих объектов, что зависит как от размера диафрагмы, так и от степени усиления регистрируемого сигнала.

Помимо диаметра конфокальной диафрагмы толщина оптического слоя зависит от длины волны возбуждающего света, числовой апертуры объектива, показателя преломления иммерсионной среды. В частности, чем больше числовая апертура объектива, тем меньше толщина оптического слоя.

Не менее важным параметром является разрешающая способность микроскопа. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта может оказаться размытым (две или более точек объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Джон Рэлей сформулировал принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Предел разрешения объектива микроскопа (l min) был уточнен немецким физиком Г. Гельмгольцем:

l min = 0,61λ/ n sin α,

где λ -длина волны света; n – показатель преломления иммерсионной среды; α -апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).

Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.

Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел – около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.

С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien (2006); B. J. Nair (2012).

Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).

Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.

Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги – цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.

Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.

1.4. Мультифотонная микроскопия

Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10 - 13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.

Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.

1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий

1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)

Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода – обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).

1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)

Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.

1.5.3. Локализация флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)

С помощью метода FLAP можно в реальном времени следить за перемещением флуоресцентно меченой молекулы в пространстве. Техника FLAP была разработана Graham Dunn в 2002 г. и состояла в том, что к молекулам интереса пришивали две различные флуоресцентные метки, одну из которых отбеливали, а с помощью второй следили за перемещением молекулы. Для реализации этого метода оба красителя должны визуализироваться одновременно и независимо, тогда FLAP сигнал получают путем вычитания отбеленного сигнала из неотбеленного для каждого пикселя.

1.5.4. Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)

Фёрстеровская резонансная передача энергии, или иначе диполь-дипольный перенос энергии, – это механизм переноса энергии между двумя молекулами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором, находящимся в возбужденном состоянии, и акцептором. Характерная черта данного процесса – тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции у акцептора, которая детектируется конфокальным микроскопом. При этом перенос возбуждения сопровождается уменьшением времени жизни и квантового выхода флуоресценции донора, для которого акцептор выступает в роли тушителя. Скорость переноса убывает как r –6 , где r – расстояние между донором и акцептором, что используется для измерения расстояния между двумя молекулами или между двумя метками в одной молекуле. Для характеристики этого явления вводится понятие фестеровского радиуса (R F ) – это эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50 % от максимума (для большинства систем его величина составляет 20 – 50 Å). Если расстояние между донором и акцептором превышает 10 нм, то диполь-дипольный перенос энергии не возможен. Помимо расстояния скорость переноса зависит от степени перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, от взаимной ориентации диполей донора и акцептора и от времени жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора. Константа скорости переноса энергии k et определяется выражением:

где τ d – время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.

Для реализации технологии FRET необходимо, чтобы:

1) донорный зонд обладал достаточным временем жизни для осуществления переноса энергии;

2) молекулы донора и акцептора располагались на расстоянии 1 – 10 нм друг от друга;

3) спектр поглощения флуорохрома акцептора накладывался на спектр испускания флуоресценции флуорохрома донора (примерно на 30 %);

4) для переноса энергии ориентации диполя донора и акцептора были примерно параллельны друг другу;

5) пары флуорохромов соответствовали имеющимся в конструкции микроскопа лазерам.

Наиболее часто используемые пары донор – акцептор приведены в обзоре, расположенном на сайте http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.

Существуют несколько методов исследований FRET: фотоотбеливание акцептора/донора; метод спектральной конфокальной микроскопии в применении к FRET; микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) и метод поляризации флуоресценции (Ishikawa-Ankerhold Н. С. , 2012). В зависимости от задачи данные модификации метода FRET позволяют следить за конформационными изменениями в белках, изучать кинетику ферментативных реакций, исследовать белок-белковые и другие взаимодействия. Например, по изменению FRET-сигнала между Gá иGâã субъединицами G-белка, слитыми с флуоресцирующими белками CFP и YFP, можно охарактеризовать динамические характеристики диссоциации G-белка в живых клетках; две субъединицы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов á4 и â2, слитые с YFP и CFP, послужили основой для разработки клеточных систем, на основе которых с применением спектральной конфокальной микроскопии показана возможность измерять уровень á4â2-рецепторов и изучать процессы их сборки-диссоциации под воздействием различных стимулов. С помощью методики FLIM смогли в системе реального времени отслеживать уровень фосфорилированной формы эпидермального фактора роста (ЭФР), для чего к ЭФР пришили GFP, а к антителам, реагирующим с фосфоЭФР, – Cy3 (Grigsby C. L. , 2012; Zeug A. , 2012).

Литература

Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.

Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.

Олейников В. А . Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.

Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.

Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.

Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике:в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.

Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.

Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G . Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.

* * *

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии (Коллектив авторов, 2014) предоставлен нашим книжным партнёром -

Введение.

Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа (см. ) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 1б ), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б ) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 1в) . Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г) . Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 1а. Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 1б. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 1в. Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 1г. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива
(для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в ) имеет вид

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рис. 2 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.

Рис. 2. Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева .

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

в то время как для обычного микроскопа

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Рис. 3. Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).
Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого [1 ].

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании - это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 4 .

В конфокальном микроскопе, благодаря пинхолу, проводится детекция флуоресценции в одном участке объекта, находящемся в фокусе, с минимальным влиянием флуоресценции окружающих участков за счет перестройки оптической системы в каждый момент времени . Такой способ позволяет значительно повысить разрешающую способность микроскопа по всем трём осям, и избежать засвечивания от подлежащих слоёв образца и слоёв лежащих над плоскостью наблюдения. В качестве источника света используется лазер. За объективной линзой находится небольшая диафрагма. Это нужно чтобы испускаемый свет, проходил через нее и регистрировался, а свет других точек, задерживался диафрагмой и лазер освещает не все поле зрения. В результате визуализация проводится в рамках одного оптического среза. В ходе работы проводится съёмка серии оптических срезов образца или перестройки, на основании чего можно получить его трёхмерную реконструкцию . Однако необходимость сканирования множества участков замедляет процесс работы, и конфокальный микроскоп может получить всего несколько изображений в секунду . Ещё одним фактором, замедляющим работу конфокальных микроскопов, является переход от одного оптического среза к следующему. Сканирующие конфокальные микроскопы, как правило, основаны на следующем принципе: образец фиксируется на определённом уровне, изображение считывается под контролем гальванометрического сканера, затем образец перемещается по вертикальной оси и процедура повторяется . Ускорить процесс сканирования можно сократив затраты времени на каждую точку, однако это снижает чувствительность метода и соотношение сигнал/шум. Скорректировать падение чувствительности можно было бы путём повышения интенсивности освещения, но в этом случае возможно повреждение образца светом и его обесцвечивание .

В системе конфокальной микроскопии единичный пинхол системы заменяется множеством пинхолов, обеспечивающих освещение и получение изображений многих точек образца единовременно. Эти пинхолы расположены на вращающемся по спирали, обеспечивая, в итоге, равномерное освещение образца . Чтобы между отверстиями не происходило засвечивания, они должны находиться на расстоянии, равном десяти их диаметрам, друг от друга . С помощью подобных систем можно получить изображение препарата гораздо быстрее - за одну секунду конфокальные микроскопы на основе системы позволяют получать десятки и сотни изображений.

Конфокальная микроскопия сочетает возможность наблюдения тонких оптических срезов, с высокой чувствительностью флуоресцентной микроскопии. Метод хорошо подходит для исследований динамики цитоскелета, движения везикул и органелл, и других задач, связанных с прижизненным наблюдением клеток. Он является более щадящим по отношению к живым клеткам благодаря тому, что продолжительность освещения каждого участка образца значительно сокращается по сравнению обычным конфокальным микроскопом. Систему можно собрать как на прямом, так и на инвертированном микроскопе, но, всё же, предпочтительно использовать инвертированный , поскольку такой дизайн микроскопа позволяет исследовать живые объекты и культуры клеток.

Для съёмки изображений, получаемых путём микроскопии, может использоваться конфокальный микроскоп c камерой ПЗС, а не детекторы на основе фотоумножителей. Детекция с использованием фотоумножителя позволяет значительно усилить сигнал, но создаёт дополнительные шумы. Охлаждаемые ПЗС-камеры микроскопа, напротив, позволяют получать прижизненные изображения крупного формата, с меньшим количеством шумов .

Двойная система был предложен компанией Yokogawa Electric Corporation. Вторая фокусирующая система при этом расположена так, чтобы встроенные в него линзы располагались перед отверстиями на первом, он осуществляет фокусирование света. Сейчас это наиболее распространённые системы для сборки конфокальных микроскопов. Размер используемых в них пинхолов фиксирован, он оптимален 100× увеличения. Пинхолы систем Yokogawa имеют диаметр 50 мкм, через каждый из них может быть получено изображение фрагмента оптического среза диаметром 500 нм. Синхронизация скорости и длительности съёмки определяет качество изображения .

При использовании эффекта полного внутреннего отражения (TIRF) конфокального микроскопа можно получить сведения о процессах, происходящих в тонком поверхностном слое образца, например, непосредственно под мембраной. Для этого используется рассеяние небольшого количества света в виде затухающей волны при полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела сред. Система, работающая на данном принципе, может быть объединена с системой в составе одного конфокального микроскопа. Для переключения между режимами необходима турель, удаляющая фильтры при микроскопии с использованием системы переключения между камерами. Методики активного освещения - фотообесцвечивание, фотоактивация и фотоконверсия флуорохромов, предназначены для исследования динамических процессов в клетке. Они могут быть реализованы на микроскопе, оснащённом данной системой лазерной сканирующей микроскопии, с использованием отдельных источников света. В сканирующих конфокальных системах фотообесцвечивание проводится с помощью того же лазера, что и получение изображения за счёт изменения его интенсивности, в результате одновременно проводить эти процедуры нельзя, что затрудняет исследование молекул с высокой подвижностью . Для качественной обработки полученных изображений требуются большие вычислительные мощности компьютера. Производители медицинского оборудования выпускают новейшие образцы данного вида оборудования, которые разделяют лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Оборудование получило широкое применение в области биофизики, медицины, молекулярной и клеточной биологии.

Таким образом, спиннинг диск конфокальная микроскопия - представляет собой экономичный и точный способ исследования биологического материала с высоким разрешением, во многом заменяющий конфокальную микроскопию, прежде всего при решении задач, связанных с наблюдениями за живыми объектами. Развитие метода и разработки компании Andor позволили создать конфокальные системы, позволяющие работать без использования лазерных источников света, что снизило стоимость оборудования для исследований подобного класса.

1. Wilson T. Spinning-disk microscopy systems / Cold Spring Harb Protoc. 2010. - 2010. - V.11.
2. Thorn K. Spinning-disk confocal microscopy of yeast / Methods Enzymol.- 2010. V. 470.- P.581-602.
3. Winter PW, Shroff H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging / Curr Opin Chem Biol. - 2014. - V.20. - P. 46-53.
4. Stehbens S, Pemble H, Murrow L et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods Enzymol. - 2012. - V.504. - P.293-313.

Конфокальный микроскоп Nikon. Изображение дендритной клетки, выделенной из костного мозга, экспрессирующей химерный белок MHC II -GFP (5 мкм). Vyas JM . Insights into dendritic cell function using advanced imaging modalities / Virulence. - 2012. - V.3, N.7. - P. 690-694. Конфокальная микроскопия

Прижизненное изображение распределения нейтрофилов в эмбрионе D. rerio. A,B - конфокальная микроскопия, C, D. Lam PY1, Fischer RS, Shin WD, Waterman CM, Huttenlocher A. Spinning disk confocal imaging of neutrophil migration in zebrafish / Methods Mol Biol. - 2014. - V.1124. - P.219-33.

Обычные классические микроскопы не всегда эффективны при проведении сложных исследований. Если для наблюдения крупных объектов их качеств бывает достаточно, то для исследования клеток они дают искажения. Конфокальные приборы лишены многих недостатков обычного микроскопа. В них есть важный элемент - диафрагма, - который отсекает поток фонового рассеянного света.

Каждую единицу времени регистрируется изображение только от одной точки объекта. Это реализуется за счет диафрагмы микроскопа, расположенной за линзой объектива. Она пропускает свет от одной точки, а свет от других точек задерживается. В следующий момент времени оптическая конфокальная система перестраивается (либо перемещается образец), и в диафрагму попадает свет от другой точки. Затем эти точки складываются в единую картину.

Лазером освещается не весь образец, а только определенная его точка, свет от которой и попадает в диафрагму. Соседние области становятся вторичными источниками света, однако диафрагма их отсекает. Регулируя диаметр диафрагмы, наблюдатель может точно устанавливать толщину оптического слоя у фокуса лазерного луча. Тем самым обеспечивается более качественное изображение по оси Z, что является проблемой для многих обычных микроскопов.

Управляет оптической системой компьютер. Наблюдателю не нужно смотреть в окуляр: изображение обрабатывается программой и выводится на экран монитора. Очень важно правильно установливать микроскопы, так как они чувствительны к вибрациям. Для удобства работы и передачи информации, компьютер микроскопа оснащается USB-портами и возможностью подключения к локальной сети и Интернет. Жесткий диск должен быть вместительным, чтобы хранить большое количество информации.

ООО «Мелитэк» поставляет лазерные конфокальные микроскопы. Это современное исследовательское оборудование, которое значительно отличается по своим возможностям от обычных световых микроскопов. С его помощью можно получить не только двухмерные, но и трехмерные изображения, получить информацию о профиле поверхности, измерить толщину полупрозрачных покрытий и пр.

Лазерный конфокальный микроскоп находит свое применение в качестве инструментального микроскопа для измерения линейных размеров, углов, радиусов и пр. Благодаря точности измерения такие микроскопы подходят для контроля качества измерительных, металлообрабатывающих и медицинских инструментов, микроэлектронных компонентов и иных деталей, контроль которых подразумевает проведение измерений в плоскостях XY, XZ и YZ, Одной из особенностей микроскопа LEXT OLS5000 является возможность построения моделей и проведения измерений поверхностий с углом наклона до 87.5 0

Лазерный микроскоп дает возможность изучать структуру и топографию поверхности с возможностью определения перепадов высоты до 6 нм у прозрачных и непрозрачных образцов, что обуславливает его широкое применение в материаловедении, криминалистике и микроэлектронике. Благодаря лазерному источнику света с длиной волны 405 нм подсветке, конфокальной оптической схеме, а так же применении. ФЭУ вместо обычных CMOS или CCD детекторов микросоп LEXT OLS5000 обладает очень малой глубиной резкости, что позволяет определять высоту фокальной плоскости и строить высокоточные 3D модели поверхности. Специальное программное обеспечение позволяет проводить измерение профиля, площади и объема полученных моделей. В плоскости разреза модели можно проводить измерение линейных размеров, радиусов окружностей и углов. Изображения и модели сохраняются в специальном формате, который позволяет провести дополнительные измерения при необходимости.

Характерные особенности, нового конфокального микроскопа LEXT OLS5000:

• определение перепада высот 6 нм
• латеральное разрешение 120 нм
• гарантированная точность измерения линейных размеров на изображениях, полученных методом панорамной сшивки;
• высокая скорость сканирования благодаря специальным алгоритмам;
• повышенная контрастность за счет двойной конфокальной схемы
• цветные изображения с разрешением 4К;
• возможность работать с образцами различных размеров и формы
• инновационные алгоритмы подавления шумов при сканировании.

Специальная модель рамы позволяет проводить измерения образцов высотой до 210 мм, а новые объективы, скорректированные для работы с лазером 405 нм с увеличенной рабочей дистанцией, позволяют исследовать поверхности в углублениях до 25 ммОписания и технические характеристики микроскопов для измерения линейных размеров, представленных в каталоге ООО «Мелитэк», вы найдете на нашем сайте. Если у вас есть вопросы, на них готовы ответить наши сотрудники.

Оптическая микроскопия также интенсивно развивается с использованием новейших достижений техники, информационных и компьютерных технологий. Это приводит к усовершенствованию имеющейся аппаратуры и методик ее применения, что обусловливает появление новых методов, в частности конфокальной микроскопии.

Конфокальный микроскоп отличается от «классического» оптического прибора тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценная картина строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Таким образом, в своеобразной форме реализуется принцип растровой электронной микроскопии, что позволяет сколь угодно долго регистрировать и обрабатывать сигнал с каждой отдельно взятой точки.

В обычном микроскопе в фотоприемное устройство свет попадает одновременно из различных точек образца. В конфокальном микроскопе, для того чтобы регистрировать свет только от одной точки, после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и регистрируется, а свет от остальных точек задерживается диафрагмой, как это показано на рис. 15.31.

Рис. 15.31

Еще одна особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в окрестностях анализируемой точки. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки не всегда обосновано. Альтернативой является применение светоделительной пластинки, гак чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рассмотрим теперь математическую модель количественной оценки изменения контрастности при применении конфокальной микроскопии. Поскольку в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки представляет собой произведение независимых вероятностей того, что фотон попадет в точку с ее координатами, и что фотон, вышедший из этой точки, будет зарегистрирован.

В соответствии с критерием Рэлея для разрешения получается, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но несущественно. Для конфокального микроскопа имеем выражение для разрешения г

В то время как для обычного микроскопа

где А." = Х/п; п - коэффициент преломления; 0 - апертурный угол; D - диаметр апертуры; F- фокусное расстояние.

Основное достоинство конфокального микроскопа - не увеличение разрешения (в смысле критерия Рэлея), а существенное повышение контрастности. Тусклый объект с интенсивностью, к примеру, в 200 раз меньшей, чем у яркого, в обычный микроскоп не виден, хотя расстояние между объектами может быть намного больше того, что предписано критерием Рэлея. Напротив, конфокальный микроскоп такой объект должен зарегистрировать.

Важным параметром является размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, снижает отношение сиг- нал/шум и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Но размер диафрагмы, примерно в 3-5 раза больший пятна Эйри, представляется наиболее подходящим. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Развитием идеи конфокальной микроскопии явилась разработка конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), что было вызвано потребностью в более чувствительных и метрологически строгих средствах анализа формы и пространственной структуры наблюдаемых объектов. Схема КЛСМ с основными функциональными связями показана на рис. 15.32.

Рис. 15.32. 1 - координатный столик; 2- исследуемый образец;

3,6 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 7, 9- игольчатые диафрагмы; 8- приемник излучения; 10 - лазер; 11 - блок управления; 12 - компьютер; 13 - привод для сканирования по оси Z

Особенность КЛСМ заключается в возможности послойного изображения исследуемого объекта с высоким разрешением и низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или с использованием столика со специальными флуоресцентными зондами, а также особыми методами ограничения световых потоков.

Разрешение КЛСМ определяется как оптической системой, так и электронным трактом обработки информации. Поэтому в конструкции КЛСМ, его схемах должны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг сканирования, характеристики детектора, а кроме того, выбраны оптимальные алгоритмы обработки и соответствующее программное обеспечение.

В общем случае глубина резкости КЛСМ зависит от апертуры, длины волны, когерентности источников света и размеров игольчатой диафрагмы. Игольчатая диафрагма (ИД) является основным элементом конструкции, отличающим КЛСМ от других типов микроскопов. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, которые не совпадают с фокальной плоскостью или находятся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости.

Выбор оптимального диаметра ИД важен для получения требуемых характеристик прибора. Соотношения для оценки латерального разрешения и глубины резкости КЛСМ получаются в предположении, что ИД имеет малое отверстие, являясь светящейся точкой. Реально размер ИД конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости.

При небольшом диаметре ИД световой поток становится малым, что уменьшает отношение сигнал/шум и снижает контрастность. При большом диаметре эффективность диафрагмы снижается за счет уменьшения апертуры.